W diagnostyce zakażeń grzybiczych stosuje się różne badania diagnostyczne  m.in. badania mikroskopowe, metody mikrobiologiczne, serologiczne (wykrywanie antygenów i przeciwciał), badania oparte na biorezonansie komórkowym, oraz metody genetyczne. Badanie może zostać wykonane na podstawie próbki krwi żylnej pacjenta. Wskazaniem do jego wykonania jest podejrzenie, że pacjent cierpi na kandydozę układową, w której mogło dojść do zakażenia narządów wewnętrznych.

Wysoka częstość występowania kandydoz i wysoka śmiertelność u chorych z immunosupresją (30–70%) spowodowały dążenie do opracowania czułych i swoistych metod diagnostycznych i odpowiednich strategii leczenia grzybic. Diagnostyka zakażeń grzybiczych opiera się na badaniach mikroskopowych, posiewach mikro-biologicznych i identyfikacji wyhodowanych gatunków.

Istotnym problemem podczas diagnostyki chorób grzybiczych przewodu pokarmowego jest obecność w kale drożdżaków Candida, która jest naturalna nawet u zdrowych ludzi. Zatem wykonywanie badania posiewu kału na grzyby mija się z celem, ponieważ nie można potwierdzić bądź wykluczyć infekcji grzybiczej przewodu pokarmowego. Wzrost kolonii drożdżaków średnio obfity (+++) lub obfity (++++) może świadczyć jedynie o chwilowym ich nadmiernym rozmnażaniu w obrębie jelita grubego spowodowanym zjedzeniem nadmiernej ilości cukrów prostych bądź węglowodanów złożonych.

Diagnostyka grzybiczych infekcji górnego odcinka przewodu pokarmowego (jama ustna, przełyk, żołądek) może opierać się na ocenie wyniku badania endoskopowego z pobraniem wycinków ze zmienionych chorobowo miejsc, pozwalające na uwidocznienie komórek grzyba wnikających do błony śluzowe. W pewnych sytuacjach(np. kandydoza jamy ustnej i przełyku) za wystarczające do postawienia rozpoznania uznaje się wykazanie obecności strzępek i pseudostrzępek w badaniu wymazu szczoteczkowego pobranego z typowo wyglądających zmian chorobowych.

W diagnostyce laboratoryjnej grzybic stosuje się:

  Bezpośrednie badania mikroskopowe

Ocena mikroskopowa preparatów bezpośrednich ma szczególne znaczenie w diagnostyce mikologicznej, gdyż umożliwia szybkie stwierdzenie infekcji grzybiczej, a niekiedy nawet wstępną identyfikację czynnika etiologicznego zakażenia i tym samym pomoc w wyborze terapii przeciwgrzybicznej. W wielu przypadkach technika ta pozwala też ocenić orientacyjnie ilość grzybów w badanych próbkach materiału klinicznego. Badanie mikroskopowe preparatu bezpośredniego jest też pomocne w interpretacji dodatniego wyniku hodowli, zwłaszcza w przypadku izolacji grzyba pleśniowego. Preparaty bezpośrednie można przygotować z wszystkich rodzajów próbek materiałów klinicznych z wyjątkiem kału. Preparaty z płynów ustrojowych wykonuje się zawsze z osadu uzyskanego po odwirowaniu próbki. Bardzo ważna jest właściwa objętość uzyskanej próbki klinicznej, odpowiedniej dla danego rodzaju i lokalizacji zakażenia. W diagnostyce mikologicznej stosowane są następujące techniki: preparaty niebarwione, preparaty rozjaśnione wodorotlenkiem potasu (KOH) oraz preparaty barwione – metodą Grama (wykrywanie drożdżaków), metodą immunofluorescencji bezpośredniej lub tuszem chińskim (w przypadku podejrzenia zakażenia Cryptococcus neoformans), a także barwienia histopatologiczne – metodą PAS (ang. periodic acid-Schiff), Gomoriego w modyfikacji Grocotta(ang. Grocott-Gomori methenamine-silver stain) lub Giemzy. Dodatni wynik mikroskopowego badania (mikologicznego i/lub histopatologicznego) materiału biopsyjnego jest pewnym dowodem na rozpoznanie zakażenia grzybiczego. Diagnostyka grzybic z użyciem badań histopatologicznych omówiona jest szczegółowo w obszernej pracy poglądowej autorstwa Guarneri Brandt .

Hodowlę w celu identyfikacji i określenia liczby drożdżaków w badanym materiale

  Hodowla i identyfikacja szczepu grzyba wyizolowanego z materiału klinicznego nadal stanowi tzw. złoty standard w diagnostyce grzybic inwazyjnych. Metoda ta pozwala na identyfikację wyhodowanego grzyba do gatunku i umożliwia ocenę lekowrażliwości danego szczepu. Podobnie jak w przypadku badania mikroskopowego, czułość tej metody zależy od pobrania próbki właściwej dla danego rodzaju i lokalizacji zakażenia oraz o odpowiedniej objętości. Mikologiczne hodowle krwi są dodatnie w 50 – 70% przypadków (drożdżaki), i taki wynik wskazuje na inwazyjne zakażenie o tej etiologii. W przeciwieństwie do tego w przebiegu aspergilozy jest rzadko wykrywana .Wadą metod hodowlanych jest stosunkowo długi okres czasu potrzebny do uzyskania wzrostu i oceny morfologii kolonii, zwłaszcza w przypadku grzybów pleśniowych. Niestety, brak jest ujednoliconych kryteriów ilościowych, które pozwoliłby na odróżnienie kontaminacji lub kolonizacji od infekcji.

Identyfikacji grzybów dokonuje się na podstawie cech morfologicznych – wyglądu kolonii (awers, rewers), szybkości wzrostu, preferencji temperaturowych wzrostu, obecności zapachu, gutacji oraz cech biochemicznych. Do wstępnej identyfikacji grzybów z rodzaju Candida dostępne są podłoża chromogenne, pozwalające wykryć aktywność enzymatyczną poszczególnych gatunków, co odzwierciedla się w rożnym zabarwieniu kolonii rosnących na takim podłożu. Do identyfikacji grzybów drożdżopodobnych stosuje się testy biochemiczne, a obecnie również technikę MALDI- TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry). Otrzymane widma masowe MALDI-TOF są analizowane przez program i porównywane z widmami referencyjnymi przechowywanymi w bazie aparatu. Pozwala to na szybkie zidentyfikowanie (w ciągu kilku minut) czynnika etiologicznego infekcji, co ma szczególne znaczenie w diagnostyce inwazyjnych zakażeń grzybiczych u osób  z głębokimi zaburzeniami odporności. Interpretując wyniki badań mikrobiologicznych, należy pamiętać, że wszechobecność grzybów w środowisku i możliwość zanieczyszczenia badanego materiału mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie. Jednocześnie mimo istniejącego zakażenia grzybiczego z posiewów często nie udaje się uzyskać hodowli grzybów. Szacuje się, że dodatnie posiewy uzyskuje się tylko u 25–50% chorych z potwierdzoną grzybicą. Uzupełnieniem badań mikrobiologicznych są metody serologiczne, wykrywające w surowicy   antygeny grzybicze lub skierowane przeciwko nim przeciwciała.

Badania serologiczne

Badania te które pozwalają na wykrycie w surowicy rozpuszczalnych antygenów grzybiczych lub przeciwciał skierowanych przeciwko nim krążących w surowicy krwi lub w płynach ustrojowych. Ich czułość w niektórych przypadkach osiąga nawet 90%. Najczęściej stosowane są testy wykrywające antygen galaktomannowy typowy dla Aspergillus oraz ß-D-glukan, wykrywany w zakażeniu drożdżakami i grzybami pleśniowymi. Czułość testów opartych na metodzie immunoenzymatycznej(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay)ocenia się na 67–100%.

W diagnostyce zakażeń Candida wykrywane są ponadto:

1. Mannan
2. Enolaza
3. ß-glukan
4. D-arabinitol

Należy pamiętać, że wykonując te badania często uzyskuje się wyniki fałszywie dodatnie, np. w przypadku używania błon celulozowych w hemodializie, wacików z gazy podczas zabiegów operacyjnych lub leczenia pacjenta preparatami immunologicznymi (albuminy, globuliny). Wyniki fałszywie ujemne mogą być z kolei związane z obecnością w płynach ustrojowych enzymu – glukanazy – powodującego rozkład s-(1,3)-D-glukanu, a także wskutek obecności przeciwciał przeciw galaktomannanowi.  Badania serologiczne pozwalają na monitorowanie przebiegu zakażenia grzybiczego. Ograniczeniem przydatności badań serologicznych jest możliwość braku odpowiedzi immunologicznej u osób z upośledzeniem odporności.

Należy podkreślić, iż w diagnostyce grzybic inwazyjnych – obok badań mikologicznych – szczególnie ważną rolę odgrywają badania obrazowe (np. rtg płuc, tomografia komputerowa). W diagnostyce grzybic pomocne są również badania endoskopowe przewodu pokarmowego pozwalające na wykrycie charakterystycznych zmian błony śluzowej przełyku odpowiadające kandydozie powierzchownej.

Nowością w diagnostyce zakażeń grzybiczych są badania molekularne

pozwalające na analizę DNA i RNA grzyba. Stosowane są do szybkiej diagnostyki zakażeń grzybiczych i polegają na wykryciu grzybiczego DNA w surowicy, płynach ustrojowych (otrzewnowym, opłucnowym, mózgowo-rdzeniowym, osierdziowym) i/lub w tkankach.  Charakteryzuje je wysoka czułość i swoistość, istotną zaletą jest również krótki czas potrzebny do ich przeprowadzenia. Najszersze zastosowanie znalazła reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR, polymerase chain reaction). Metoda ta polega na powieleniu fragmentu DNA grzyba w badanym materiale przy użyciu enzymu polimerazy DNA. Swoistość badania determinują startery, komplementarne do wybranej sekwencji DNA. Możliwe jest zastosowanie starterów wykrywających fragmenty DNA występujące we wszystkich grzybach. W tych badaniach drugim etapem jest analiza produktu amplifikacji(zwiększenia), umożliwiająca określenie rodzaju czy gatunku patogenu .W badaniach metodą PCR można również stosować startery o sekwencji charakterystycznej dla danego gatunku lub szczepu. Ujemną stroną badań z zastosowaniem techniki PCR jest możliwość uzyskania fałszywie dodatniego wyniku. Wynika to z powszechnej obecności grzybów w środowisku oraz możliwości kolonizacji skóry i błon śluzowych. Dlatego też wynik badania molekularnego wykonanego z określonej tkanki należy skorelować z obecnością objawów klinicznych i/lub innych badań dodatkowych. Pojedynczy wynik PCR nie świadczy więc o zakażeniu grzybiczym – wskazane jest powtórzenie badania. Należy podkreślić, iż nie zaleca się stosowania tej techniki w rutynowej diagnostyce mikologicznej, a jedynie jako metody uzupełniającej. Obecnie trwają prace nad wdrożeniem w mikologii klinicznej nowych metod diagnostycznych opartych na badaniach molekularnych.

Innym rodzajem badań jest test w kierunku grzybów i pleśni wykonany za pomocą urządzenia medycznego BioKat MV.

Aparat ten znajduje zastosowanie w prewencji i leczeniu wielu chorób cywilizacyjnych, stanowiąc zarówno dodatkowe narzędzie diagnostyczne jak i terapeutyczne, pozwalając terapeutom uprawiać medycynę w sposób komplementarny, tj. łączyć wiedzę i doświadczenie medycyny szkolnej z metodami naturopatii.

Ogólne zasady pobierania, przesyłania i przechowywania próbek materiałów klinicznych do badań mykologicznych są następujące:

1. należy je pobrać przed rozpoczęciem terapii przeciwgrzybicznej lub po upływie co najmniej 4 tygodni od momentu zakończenia leczenia,
2. próbki pobiera się z zachowaniem zasad aseptyki i umieszcza w jałowych pojemnikach, chroniących przed zanieczyszczeniem drobnoustrojami środowiskowymi,
3. próbki powinno się dostarczyć do laboratorium w czasie krótszym niż 2 godziny.

Mikroskopowa ocena materiałów klinicznych ma zasadnicze znaczenie w diagnostyce zakażeń grzybiczych, ponieważ w wielu przypadkach umożliwia szybkie stwierdzenie infekcji, orientacyjną ocenę ilości grzybów a nawet wstępną identyfikację patogenu. Ocena preparatów bezpośrednich ułatwia wybór odpowiedniego podłoża i metod hodowlanych, co zwiększa szansę izolacji grzyba.Preparaty bezpośrednie powinny być przygotowywane ze wszystkich materiałów klinicznych, z wyjątkiem kału. W sytuacji, gdy ilość materiału jest niewystarczająca do wykonania zarówno preparatu bezpośredniego, jak i posiewu, najpierw należy założyć hodowlę – ze względu na większą czułość tej metody diagnostycznej. Do izolacji grzybów z materiałów klinicznych wykorzystuje się wiele różnych podłoży mikrobiologicznych: stałych, płynnych, naturalnych (niesyntetycznych) oraz syntetycznych.

 Sposób pobierania poszczególnych materiałów klinicznych

Skóra

Próbki ze skóry pobiera się w przypadku podejrzenia grzybicy powierzchniowej, podskórnej lub skórnej manifestacji grzybicy uogólnionej. Z łuszczących się zmian na skórze zaleca się pobranie zeskrobin skórnych. Wcześniej należy odkazić powierzchnię zmienionego chorobowo miejsca 70% alkoholem etylowym Jeżeli na skórze występują zmiany pęcherzykowe, do badania pobiera się wierzchołek pęcherzyka. Jeżeli pobranie łusek skórnych jest niemożliwe oraz w przypadku wysięków zapalnych, wskazane jest pobranie wymazu za pomocą wymazówki.

Paznokcie

Powinno się pobierać próbki paznokci zgrubiałych, przebarwionych, kruszących się, rozdwajających, o nierównej powierzchni. Przed pobraniem, należy odkazić płytkę paznokciową 70% alkoholem etylowym. Za pomocą skalpela powinno się zeskrobać powierzchnię płytki – pierwszą partię należy odrzucić, głębsze warstwy przeznacza się do badania. Do badania nadają się również obcięte nożyczkami fragmenty płytki paznokciowej oraz materiał gromadzący się pod paznokciem. Trzeba pamiętać, że dermatofity rozwijają się w głębszych warstwach paznokci a na powierzchni nie występują. W przypadku drożdżycy paznokci obserwuje się stan zapalny wałów paznokciowych z obrzękiem, zaczerwienieniem, niekiedy wysiękiem zapalnym. Drożdżaki w tym przypadku można wykryć przez umieszczenie pod wałem paznokciowym nitki zanurzonej w płynnym podłożu do hodowli grzybów i pozostawienie jej pod opatrunkiem na 24 godziny.

Włosy

Należy pobrać do badania co najmniej 10–15 włosów ze środka ogniska zakażenia. W przypadku zakażenia niektórymi gatunkami Microsporum, zakażone włosy badane w ciemni lampą Wooda fluoryzują jasnym, zielononiebieskim światłem.

Mocz

Do badań mikrobiologicznych pobiera się mocz z pierwszej porannej porcji, metodą środkowego strumienia, za pomocą cewnika lub poprzez nakłucie nadłonowe pęcherza moczowego.

Materiał z pochwy i szyjki macicy

Najczęściej pobiera się wymaz lub aspirat za pomocą strzykawki.

 Krew i szpik kostny

Krew pobiera się w przypadku podejrzenia głębokiego zakażenia grzybiczego – narządowego lub uogólnionego (rozsianego). Krew powinna zostać pobrana około 30 minut przed wystąpieniem szczytu gorączki .Trzeba pobrać co najmniej dwie próbki z dwóch różnych wkłuć. Szpik kostny należy pobrać metodą aspiracji (3–5 ml materiału) i umieścić w jałowym pojemniku.

Plwocina

Pobiera się ją rano, na czczo, po umyciu zębów, usunięciu protezy zębowej i wypłukaniu jamy ustnej przegotowaną wodą. Materiał do badań można uzyskać przez samoistne, głębokie odkrztuszenie, ewentualnie poprzez uzyskanie plwociny indukowanej, na przykład po inhalacji 10% roztworem chlorku sodu.

Popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL)

Ten materiał jest przydatny w diagnozowaniu  zapalenia płuc wywołanego przez Pneumocistis jiroveci lub zakażenia Cryptococcus neoformans. Materiał pobiera się w trakcie bronchoskopii.

Kał

Dodatni wynik hodowli próbek kału nie zawsze oznacza zakażenie, gdyż na przykład grzyby z rodzaju Candida mogą w sposób stały lub przejściowy kolonizować jelita zdrowych osób. W związku z licznymi problemami interpretacyjnymi wyników badań kału, materiał ten bada się w kierunku zakażeń grzybiczych tylko w rzadkich, uzasadnionych klinicznie przypadkach.

Diagnostyka grzybic wymaga ścisłej współpracy diagnosty laboratoryjnego z lekarzem klinicystą opiekującym się chorym, gdyż badania mikologiczne często nie są wystarczające do postawienia ostatecznej diagnozy inwazyjnego zakażenia grzybiczego, bez uwzględnienia danych klinicznych i wyników innych badań, zwłaszcza obrazowych. W zaplanowaniu badań laboratoryjnych oraz właściwej interpretacji ich wyników ważna jest informacja o objawach klinicznych chorego, stanie jego układu odpornościowego oraz – w wywiadzie – o odbytej przez pacjenta podroży do innych regionów świata. Należy podkreślić, iż mikologiczne badania laboratoryjne służą nie tylko do rozpoznania grzybic, lecz także pomagają w doborze właściwego leczenia, ocenie jego skuteczności, jak również mogą mieć wartość prognostyczną .

Literatura:

1. Arendrup MC, Bille J, Dannaoui E, et al. ECIL-3 classical diagnostic procedur es for the diagnosis of invasive fungal diseases in patients with leukemia. Bone Marrow Transplant 2012; 47: 1030-1045.
2. Barton RC. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis: from diagnosis to prediction of outcome. Scientifica 2013; http://dx.doi.org/10.1155/2013/459405.
3. Oz Y, Kiraz N. Diagnostic methods for fungal infections in pediatric patients: microbiological, serological and molecular methods. Expert Rev Anti Infect Ther 2011; 9(3): 289-298.4
4. Malhotra S, Sharma S, Bhatia NJK, et al. Recent diagnostic techniques in mycology. J Med Microb Diagn 2014;
5. Seferyńska I, Pałynyczko G, Warzocha K, Układowe zakażenia grzybicze: etiologia, rozpoznanie i nowe możliwości lecznicze. Acta Haematol Pol 2005; 36(1):45-54.

6. Biliński P, Seferyńska I, Warzocha K. Diagnostyka i leczenie układowych zakażeń grzybiczych w onkohematologii. Onkol Prakt Klin 2008; 4(1): 15-24.

7. Reiss E, Tanaka K, Bruker G, et al. Molecular diagnosis and epidemiology of fungal infections. Med Mycol 1998; 36(Suppl 1): 249-257.
8. Haque A. Special stains use in fungal infections. Connection 2010; 187-194.
9. Krzyściak P, Skora M, Macura AB. Atlas grzybow chorobotworczych człowieka, 2011.
10. Cuenca-Estrella M, Verweij PE, Arendrup MC, et al. ESCMID* guideline for the diagnosis and management of Candida diseases 2012: diagnostic procedures. Clin Microbiol Infect 2012; 18(Suppl. 7): 9-18.
11. Guarner J, Brandt ME. Histopathologic diagnosis of fungal infections in the 21st century. Clin Microbiol Rev 2011; 24(2): 247-280.
12. Dzierżanowska D. Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń grzybiczych. Med. Prakt 2009, 119: 35-39.
13. Kozel TR, Wickes B. Fungal diagnostics. Cold Spring Harb Perspect Med 2014; 4: a019299.
14. Farmakiotis D, Kontoyiannis DP. Emerging issues with diagnosis and management of fungal infections in solid organ transplant recipients. Am J Transplant 2015 (in print).
15. Kędzierska A, Pietrzyk A, Kędzierska J, i wsp. Immunodiagnostyka inwazyjnych zakażeń grzybiczych o etiologii Aspergillus Candida w chorobach rozrostowych układu krwiotworczego, Acta Haematol Polonica 2006; 2: 539-551.

16. Atkins SD, Clark IM. Fungal molecular diagnostics: a mini review. J Appl Genet 2004; 45(1): 3-15.

17. Seweryn M, Hołowiecki J, Wojnar J, i wsp. Aktualne rekomendacje w leczeniu infekcji grzybiczych u pacjentow w neutropenii i w nowotworowych zaburzeniach odporności. Acta Haematol Pol 2006; 2: 167-183.
18. Procop GW. Molecular diagnostics for invasive fungal infections. A call for refinement and implementation. J Mol Diagn 2010; 12: 17-19.

19. Birmingham N, Luettich K. Polymerase chain reaction and its applications. Curr Diagn Pathol, 2003; 9: 159-164.

20. Garczewska B, Dzierżanowska D. Zastosowanie metod biologii molekularnej w rozpoznawaniu zakażeń grzybiczych. Med Dośw Microbiol 2002; 34: 157-165.
21. Vijayan T, Chiller T, Klausner JD. Sensitivity and specificity of a new cryptococcal antigen lateral flow assay in serum and cerebrospinal fluid. MLO Med Lab Obs 2013; 45(3): 16-20.
22. Held J, Kohlberger I, Rappold E, et al. Comparison of (1->3)-β-D-glucan, mannan/anti-mannan antibodies, and Cand-Tec Candida antigen as serum biomarkers for candidemia. J Clin Microbiol 2013; 51(4): 1158-1164.
23. Sendid B, Tabouret M, Poirot JL, et al. New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J Clin Microbiol 1999; 37(5): 1510-1517.

24. Marr K.A. New approaches to invasive fungal infections. Curr. Opin. Hematol. 2003; 10: 445–450.

25. Dzierżanowska D., Dąbkowska M., Garczewska B. Diagnostyka zarażeń grzybiczych. W: Grzybice narządowe. Medycyna Praktyczna, Kraków 2003: 13–20.

26.Pacho R.A., Zdunek P., Michalak M. i wsp. Znaczenie badań obrazowych w rozpoznawaniu zakażeń grzybiczych u chorych z niewydolnym układem odpornościowym. Zakażenia 2005; 5: 12–18.